熒光顯微鏡的標本制作要求

1、載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片， 一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

2、蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光 ，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起到不同干涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本。

3、標本

組織切片或其他標本不能太厚，若太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重疊或雜質掩蓋，影響判斷。

4、封裱劑

封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去 。

5、鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。

使用方法編輯

（1）打開燈源，超高壓汞燈要預熱15min才能達到最亮點。

（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發濾片，在物鏡的后面裝上相應的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。

（3）用低倍鏡觀察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。

（4）放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動，否則會不穩定，影響汞燈壽命。

（5）觀察。例如：在熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，觀察到經0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發產生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。

注意事項編輯

（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

（2）應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。

（6）標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。長時間的激發光照射標本，會使得熒光衰減和消失現象，故應盡可能縮短照射時間。暫時不觀察時可用擋光板遮蓋激發光。

（7）標本觀察時候應采用無熒光油，應避免眼睛直視紫外光源。

（8）電源應安裝穩壓器，電壓不穩會降低熒光燈的壽命。

熒光顯微鏡與光學顯微鏡的區別

熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區別：

1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；

2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；

3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。

熒光顯微鏡也是光學顯微鏡的一種，主要的區別是二者的激發波長不同。由此決定了熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡結構和使用方法上的不同。

熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。