熒光顯微鏡標本制作要求及制作方法

熒光顯微鏡標本制作要求

(一)載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。

(三)標本

組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。

三、使用熒光顯微鏡的注意事項

(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

(2)應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

(3)防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

(4)檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節　省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。

(6)標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。

(7)熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。

四、熒光圖像的記錄方法

熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。

熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。

標本的制作方法

樣品須經過石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以.

作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

石蠟切片的過程：

1. 取材: 刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜. 取材時間越快越好.

2. 固定: 組織取下后應立即放入10%福爾馬林(相當于4%甲醛)固定.

注意: (1). 固定液量應為組織塊體積的40倍.

(2) 固定時間固定時間與使用的固定液種類和組織塊大小, 溫度等有關. 一般為3—24h.

(3)固定溫度大多可在室溫固定, 在低溫(4℃)時間應延長.

(4)固定容器應大些.

3. 漂洗: 流水沖洗2—10h.

4. 脫水: 從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).

5. 透明: 組織塊脫水后必須經過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑, 而使石蠟進入組織塊. 常用二甲苯, 一般浸泡30m即可.

6. 浸蠟: 組織經透明后在熔化的石蠟內浸漬的過程稱浸蠟. 一般需經2—3次浸漬才能完成, 總時間為3—4h. 用于浸蠟的石蠟熔點為52—56℃.

7. 包埋: 先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入. 包埋面必須平整. 包埋后石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8. 切片: 修塊→切片→展片→撈片→烤片.

也可作冰凍切片.

熒光染料的配制：

儲藏液：1mg/ml dapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時須避光，10min左右

用pbs沖去多余染液即可觀察。