一．相差鏡檢法(Phasecontrast)

在光學顯微鏡的發展過程中,相差鏡檢術的發明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就.我們知道,人眼只能區分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本.

相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現象,將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差,即使是無色透明的物質也可成為清晰可見.這大大便利了活體細胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡.

相差顯微鏡的基本原理是,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見.光線透過標本后發生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變為1/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差.在構造上,相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:

1.環形光闌(annulardiaphragm)位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上.

2.相位板(annularphaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ.分為兩種:

1.A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加變亮,形成亮反差(或稱負反差).

2.B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結構比周圍介質更加變暗

二．暗視野觀察(Darkfield)

暗視野實際是暗場照明發.它的特點和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線.因此,視場成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現明亮的象.

暗視野的原理是根據光學上的丁道爾現象,微塵在強光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因為強光繞射造成的.若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見.

m..m暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡.它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象.暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察,最高達0.02—0.004

三．明視野觀察(Brightfield)

明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應用于病理、檢驗,用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能.

四.偏光顯微鏡(Polarizingmicroscope)

偏光顯微鏡的特點

偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡.凡具有雙折射的物質,在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當然這些物質也可用染色發來進行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡.

偏光顯微鏡的特點,就是將普通改變為偏光進行鏡檢的方法,以鑒別某一物質是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性).

雙折射性是晶體的基本特性.因此,偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物,化學等領域.在生物學和植物學也有應用.

五．微分干涉稱鏡檢術(DifferentialinterferencecontrastDIC)

微分干涉鏡檢術出現于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖象呈現出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優點,觀察效果更為逼真.

原理;

微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束.分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等,光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體,在相位上略有差別.由于兩光束的裂距極小,而不出現重影現象,使圖象呈現出立體的三維感覺.

DIC顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡,技術設計要復雜得多.DIC利用的是偏振光,有四個特殊的光學組件:偏振器(polarizer)、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器(analyzer).偏振器直接裝在聚光系統的前面,使光線發生線性偏振.在聚光器中則安裝了偌瑪斯斯棱鏡,即DIC棱鏡,此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光(x和y),二者成一小夾角.聚光器將兩束光調整成與顯微鏡光軸平行的方向.最初兩束光相位一致,在穿過標本相鄰的區域后,由于標本的厚度和折射率不同,引起了兩束光發生了光程差.在物鏡的后焦面處安裝了第二個偌瑪斯斯棱鏡,即DIC滑行器,它把兩束光波合并成一束.

生物顯微鏡的幾種觀察方法都有什么作用?